Лабораторна робота 2.1 (14) Тема: Хімічні та фізичні властивості хлорофілу Фотосинтез визначають як процес перетворення електромагнiтної енергiї свiтла в потенцiйну енергiю…
Лабораторна робота 2.1 (14) Тема: Хімічні та фізичні властивості хлорофілу Фотосинтез визначають як процес перетворення електромагнiтної енергiї свiтла в потенцiйну енергiю хiмiчних зв’язкiв, яка далi використовується для бiосинтезу складних органiчних речовин. Головну роль у цьому процесi вiдiграє використання енергiї свiтла для вiдновлення СО2 до рiвня вуглеводiв. Але в процесi фотосинтезу можуть вiдновлюватися сульфат i нiтрат, енергiя свiтла використовується також на транспорт речовин через мембрани i на iншi процеси. Фотосинтез здiйснюють вищi рослини, водоростi i деякi бактерiї. Вiн має вирішальну роль в енергетицi бiосфери. Хiмiчнi властивостi хлорофiлу Хлорофіл – складний ефір дикарбонової хлорофілінової кислоти з двома спиртами: фітолом і метанолом. Загальна формула хлорофілу а C55H72O5N4Mg, або COOCH3 C32H39N4Mg COOC20H39 Хлорофіл b має формулу С55Н70О6N4Mg. Замість метильної групи хлорофіл b має альдегідну групу. У карбоксильних групах водень заміщений залишками метилового спирту (CH3) і фітолу (C20H39). Найважливійшою частиною молекули хлорофілу є центральне ядро, що складається з чотирьох пірольних п’ятичленних кілець, зв’язаних між собою вуглецевими містками і утворюють велике порфіринове ядро з атомами азоту всередині, зв’язаними з атомом магнію. Хлорофiл екстрагується з тканин листка органiчними розчинниками: спиртом, ацетоном, бензином та iн. Зеленi та жовтi пiгменти мають рiзну розчиннiсть у спиртi i бензинi. На цьому базується розподiл пiгментiв за Краусом. Хлорофiл легко реагує як з кислотами, так i з лугами. При взаємодiї з лугами спостерiгається омилення хлорофiлу, внаслiдок чого утворюються два спирти i лужна сiль хлорофiлiну. В iнтактнiй рослинi вiд хлорофiлу може вiдщеплюватися фiтол пiд дiєю ферменту. Якщо з молекули хлорофiлу за допомогою кислоти витiснити магнiй, то утворюється продукт бурого забарвлення –феофiтин. При цьому атом магнiю в молекулi хлорофiлу замiщується на два атоми водню. Водень можна знову замiнити на метал, якщо додати сiль слабкої кислоти. Бурий колiр зникає i витяжка знову набуває зеленого забарвлення. Мета роботи: вивчити хiмiчнi властивостi хлорофiлу. Матерiали та обладнання. 1. Листки рослин. 2. Ступки. 3. Склянi палички. 4. Розчинники. 5. Лійки. 6. Ножицi. 7. Фiльтрувальний папiр. 8.Пробiрки в штативах. 9. 96%-вий етиловий спирт. 10. 20%-вий розчин їдкого натрiю. 11. 10%-ва соляна кислота. 12. Бензин. 13. Водяна баня. Хiд роботи Одержання спиртового екстракту пiгментiв Першим етапом роботи є одержання спиртового екстракту пiгментiв. Для цього наважку 3– 5 г листкiв подрiбнюють ножицями, потiм розтирають у ступцi, додаючи 96%-вий спирт. Витяжку фiльтрують через не дуже цупкий фiльтр у ряд пробiрок по 2–3 мл у кожну. Розподiл пiгментiв за Краусом Для розподiлу пiгментiв у першу пробiрку зі спиртовою витяжкою додають 2–3 мл бензину. Закривають пробiрку i енергiйно її струшують, пiсля чого залишають її у штативi для вiдстоювання. Спостерiгається поступове розшарування рiдини. Яскраво забарвлений верхнійбензиновий шар має зелений колір. Крім хлорофілу, який зумовив зелене забарвлення розчинника, у цьому шарі є також і каротин, забарвлення якого перекривається інтенсивним кольором хлорофілу. Інший жовтий пігмент – ксантофіл – залишається в нижньому спиртовому шарі, забарвлюючи його в золотисто-жовтий колір. Якщо пігменти розподіляються погано, слід додати декілька крапель води і знову струсити пробірку. Омилення хлорофілу У пробірки з 2–3 мл спиртового розчину пігментів додають 1 мл 20–30%-вого NaOH і струшують. Нагрівають у водяній бані. Після того, як розчин закипить, його трохи охолоджують. Додають 4 мл бензину і 3 краплі води. Пробірки енергійно струшують і ставлять у штатив для відстоювання. У бензиновому шарі розміщені каротин і ксантофіл, а в спиртовому – натрієва сіль хлорофілінової кислоти. Лужні солі хлорофіліну зберігають колір і флуоресценцію, оскільки центральне ядро молекули хлорофілу не порушене. Одержання феофітину і зворотнє заміщення водню атомом металу У дві пробірки з 3 мл спиртової витяжки пігментів додають 1–2 краплі 10%-вої соляної кислоти, енергійно струшують і спостерігають зміну кольору. Витяжка набула бурого забарвлення внаслідок утворення феофітину. Одну пробірку залишають у штативі для контролю, а іншу додають 2–3 кристали оцтовокислої міді і нагрівають на водяній бані. Спостерігається поновлення зеленого забарвлення. Звіт про роботу. Накреслити схему розподілу пігментів (за Краусом), можна схематично, але підписати в яких шарах розчинника які пігменти. Зробити висновок про розчинність пігментів у різних розчинниках. Замалювати зворотнє розміщення шарів розчинів пігментів внаслідок омилення хлорофілу. Пояснити явище феофітинізації. Контрольні запитання 1. Назвіть основні хімічні властивості хлорофілу. 2. На чому засновано розподіл пігментів за Краусом? 3. Який утворюється продукт при реакції хлорофілу з лугами? 4. Який дослід свідчить про те, що спирти фітол і метанол не визначають зелений колір хлорофілу? 5. Який дослід доводить, що показати, що Mg визначає зелений колір хлорофілу? 6. Після реакції омилення хлорофілу до витяжки додали рівний об’єм бензину. Суміш інтенсивно перемішали і дали відстоятися. Як пояснити результати спостережень? 7. Чому неполярні розчинники (бензин) не можуть повністю знебарвити листок на відміну від полярних спирту і ацетону? Спектри поглинання пігментів Кожна хімічна речовина має певний спектр поглинання, який є функцією атомної будови. Максимуми поглинання хлорофілів розміщуються в червоній і синій частинах спектра. В етиловому ефірі максимум поглинання хлорофілу а в червоній частині спектра – в межах 660–663 нм, у синій – 428–430 нм, хлорофілу b – відповідно в межах 642–644 і 452–455 нм. Хлорофіли дуже слабко поглинають оранжеве і жовте світло, зовсім не поглинають зелені та інфрачервоні промені. Мета роботи: встановити спектр поглинання пігментів. Матеріали та обладнання. 1. Спиртова витяжка пігментів листка. 2. Розчини каротину і ксантофілу (бензиновий шар, одержаний після омилення хлорофілу). 3. Піпетки. 4. Пробірки. 5. Спектроскоп. 6. Джерело світла. Хід роботи. Направляють спектроскоп на джерело світла. Регулюють ширину щілини на кінці труби спектроскопа так, щоб спектр був чіткий і достатньо яскравий. При дуже широкій щілині спектр буде розмитий, нечистий, при занадто вузькій – недостатня освітленість спектра. У кювету наливають спиртову витяжку хлорофілу. Розміщують її перед щілиною спектроскопа івизначають положення темних смуг, які відповідають променям, що поглинаються хлорофілом. Щоб встановити, як впливає на спектр поглинання різна концентрація пігменту, розводять витяжку зеленого листка у відношеннях 1:1; 1:5; 1:15. Досліджують оптичні властивості одержаних пігментів. Розглядають спектр поглинання бензинової витяжки з коренеплоду моркви, що містить каротин, і спиртовий розчин ксантофілу, одержаний при розподілі пігментів за Краусом. Звіт про роботу. Намалювати спектри поглинання спиртової витяжки із зеленого листка. Контрольні запитання 1. Назвіть основні фізичні властивості хлорофілу? 2. Чому хлорофіл зеленого кольору? 3. У яких частинах спектра спостерігається максимум поглинання хлорофілу? 4. Чим відрізняються спектри поглинання хлорофілів а та в? 5. Чому рослини зеленого кольору? 6. В якій частині спектра хлорофіл не поглинає промені? Флуоресценція хлорофілу Розчини хлорофілів у полярних розчинниках мають яскраву флуоресценцію. В етиловому ефірі у хлорофіла а спостерігається рубіново-червона флуоресценція з максимумом 668 нм, у хлорофілу b – 648 нм, тобто максимуми флуоресценції дещо зсунуті по відношенню до максимумів поглинання. Відомо, що флуоресценція – це властивість багатьох тіл під впливом падаючого світла в свою чергу випромінювати світло; при цьому довжина хвилі світла, що випромінюється, звичайно більша за довжину хвилі збуджуючого світла. Агрегований хлорофіл і хлорофіл у нативному стані (в живому листку) має слабку флуоресценцію. Це, очевидно, пояснюється поглинанням світла флуоресценції самими пігментами. Механізми флуоресценції достатньо вивчені. Поглинання молекулою хлорофілу кванта червоного світла призводить до синглетного електронзбудженого стану – S*1. При поглинанні синього світла з більш високим рівнем енергії електрон переходить на більш високу орбіту (S*2). Збуджена молекула хлорофілу повертається до основного стану різними шляхами. Віддавши частину енергії у вигляді теплоти (особливо з рівня S*1), молекула може випромінювати квант світла з більшою довжиною хвилі (правило Стокса), що проявляється у вигляді флуоресценції. Мета роботи: ознайомитися з фізичною властивістю хлорофілу – флуоресценцією. Матеріали та обладнання. 1. Спиртова витяжка пігментів листка. 2. Піпетки. 3. Пробірки. 4. Джерело світла. 5. Листки елодеї (Elodea canadensis Michx.). 6. Предметні і накривні скельця 7. Мікроскоп із синім світлофільтром. Хід роботи. Спиртову витяжку пігментів або розчин хлорофілу в бензині, одержаний при розподілі пігментів за Краусом, розташовують перед темним папером біля джерела освітлення. Розглядають у відбитому світлі. Витяжка хлорофілу буде темно-червоного кольору. Для спостереження флуоресценції в живому листку елодеї, його розташовують на предметному столику мікроскопу. Освітлюють синьо-фіолетовим світлом. Зелені пластиди починають світитися червоним світлом. Контрольні запитання 1. Інтенсивність флуоресценції хлорофілу в розчині в 10 разів вища, ніж у нативному стані. Чим це обумовлено? 2. Що таке квантовий вихід фотосинтезу? 3. Накресліть схему переходів між збудженими станами після поглинання синього і червоного світла хлорофілом. 4. Як пояснити різний колір ацетонової витяжки хлорофілу в світлі, що проходить крізь неї і у відбитому світлі? 5. Які механізми виникнення флуоресценції хлорофілу?
Лабораторная работа 2.1 (14) Тема: Химические и физические свойства хлорофилла
Фотосинтез — это процесс преобразования электромагнитной энергии света в потенциальную энергию химических связей, которая затем используется для биосинтеза сложных органических веществ. Основная роль в этом процессе принадлежит использованию энергии света для восстановления CO2 до уровня углеводов. Однако в процессе фотосинтеза могут восстанавливаться сульфат и нитрат, энергией света также используется для транспорта веществ через мембраны и на другие процессы. Фотосинтез осуществляют высшие растения, водоросли и некоторые бактерии. Он имеет решающее значение для энергетики биосферы.
Химические свойства хлорофилла
Хлорофилл — сложный эфир дикарбоновой хлорофилиновой кислоты с двумя спиртами: фитолом и метанолом. Общая формула хлорофилла а — C55H72O5N4Mg, или COOCH3 C32H39N4Mg COOC20H39. Хлорофилл b имеет формулу C55H70O6N4Mg. Вместо метильной группы хлорофилл b имеет альдегидную группу. В карбоновых группах водород замещен остатками метилового спирта (CH3) и фитола (C20H39). Наиболее важной частью молекулы хлорофилла является центральное ядро, состоящее из четырех пиррольных пятичленных колец, соединенных углеродными мостиками и образующих большое порфировое ядро с атомами азота внутри, связанными с атомом магния. Хлорофилл экстрагируется из тканей листа органическими растворителями: спиртом, ацетоном, бензином и др. Зеленые и желтые пигменты имеют различную растворимость в спирте и бензине. На этом основан разделение пигментов по методу Крауса.
Хлорофилл легко реагирует как с кислотами, так и с щелочами. При взаимодействии с щелочами наблюдается омыление хлорофилла, в результате чего образуются два спирта и щелочная соль хлорофилина. В интактном растении от хлорофилла может отщепляться фитол под действием фермента. Если из молекулы хлорофилла под действием кислоты вытеснить магний, то образуется продукт бурого цвета — феофитин. При этом атом магния в молекуле хлорофилла заменяется на два атома водорода. Водород можно снова заменить на металл, если добавить соль слабой кислоты. Бурый цвет исчезает и вытяжка снова приобретает зеленое окрашивание.
Цель работы: изучить химические свойства хлорофилла.
Материалы и оборудование:
- Листья растений.
- Ступки.
- Стеклянные палочки.
- Растворители.
- Воронки.
- Ножницы.
- Фильтровальная бумага.
- Пробирки в штативах.
- 96%-й этиловый спирт.
- 20%-й раствор едкого натра.
- 10%-я соляная кислота.
- Бензин.
- Водяная баня.
Ход работы
Получение спиртового экстракта пигментов. Первым этапом работы является получение спиртового экстракта пигментов. Для этого взвесьте 3–5 г листьев, нарежьте их ножницами, а затем растирайте в ступке, добавляя 96%-й спирт. Вытяжку фильтруйте через не слишком плотный фильтр в ряд пробирок по 2–3 мл в каждую.
Распределение пигментов по Краусу. Для распределения пигментов в первую пробирку со спиртовой вытяжкой добавляют 2–3 мл бензина. Закройте пробирку и энергично потрясите, после чего оставьте в штативе для отстаивания. Наблюдается постепенное расслоение жидкости. Ярко окрашенный верхний бензиновый слой имеет зеленый цвет. Кроме хлорофилла, который обусловил зеленое окрашивание растворителя, в этом слое также находится и каротин, окрашивание которого перекрывается интенсивным цветом хлорофилла. Другой желтый пигмент — ксантофилл — остается в нижнем спиртовом слое, окрашивая его в золотисто-желтый цвет. Если пигменты распределяются плохо, следует добавить несколько капель воды и снова встряхнуть пробирку.
Омиление хлорофилла. В пробирки с 2–3 мл спиртового раствора пигментов добавляют 1 мл 20–30%-го NaOH и встряхивают. Нагревают в водяной бане. После того, как раствор закипит, его немного охлаждают. Добавляют 4 мл бензина и 3 капли воды. Пробирки энергично струшивают и ставят в штатив для отстаивания. В бензиновом слое располагаются каротин и ксантофилл, а в спиртовом – натриевая соль хлорофилиновой кислоты. Щелочные соли хлорофилина сохраняют цвет и флуоресценцию, поскольку центральное ядро молекулы хлорофилла не нарушено.
Получение феофитина и обратное замещение водорода атомом металла. В две пробирки с 3 мл спиртовой вытяжки пигментов добавляют 1–2 капли 10%-й соляной кислоты, энергично взбалтывают и наблюдают за изменением цвета. Вытяжка приобрела бурое окрашивание в результате образования феофитина. Одну пробирку оставляют в штативе для контроля, а в другую добавляют 2–3 кристалла уксуснокислой меди и нагревают на водяной бане. Наблюдается восстановление зеленого окрашивания.
Отчет о работе. Нарисуйте схему распределения пигментов (по Краусу), можно схематично, но подписать, в каких слоях растворителя какие пигменты. Сделать вывод о растворимости пигментов в различных растворителях. Замалевать обратное размещение слоев растворов пигментов в результате омыления хлорофилла. Объяснить явление феофитинизации.
Контрольные вопросы
- Назовите основные химические свойства хлорофилла.
- На чем основано распределение пигментов по Краусу?
- Какой продукт образуется при реакции хлорофилла с щелочами?
- Какой эксперимент свидетельствует о том, что спирты фитол и метанол не определяют зеленый цвет хлорофилла?
- Какой эксперимент доказывает, что Mg определяет зеленый цвет хлорофилла?
- После реакции омыления хлорофилла к вытяжке добавили равный объем бензина. Смесь интенсивно перемешали и дали отстояться. Как объяснить результаты наблюдений?
- Почему неполярные растворители (бензин) не могут полностью обесцветить листок, в отличие от полярных спирта и ацетона?
Спектры поглощения пигментов Каждое химическое вещество имеет определенный спектр поглощения, который является функцией атомного строения. Максимумы поглощения хлорофиллов располагаются в красной и синей частях спектра. В этиловом эфире максимум поглощения хлорофила а в красной части спектра — в пределах 660–663 нм, в синей — 428–430 нм, хлорофила b — соответственно в пределах 642–644 и 452–455 нм. Хлорофиллы очень слабо поглощают оранжевый и желтый свет, совсем не поглощают зеленые и инфракрасные лучи.
Цель работы: установить спектр поглощения пигментов.
Материалы и оборудование:
- Спиртовая вытяжка пигментов листка.
- Растворы каротина и ксантофилла (бензиновый слой, полученный после омыления хлорофилла).
- Пипетки.
- Пробирки.
- Спектроскоп.
- Источник света.
Ход работы. Направляют спектроскоп на источник света. Регулируют ширину щели на конце трубы спектроскопа так, чтобы спектр был четким и достаточно ярким. При слишком широкой щели спектр будет размазанным, нечистым, при слишком узкой — недостаточная освещенность спектра. В кювету наливают спиртовую вытяжку хлорофилла. Размещают ее перед щелью спектроскопа и определяют положение темных полос, которые соответствуют лучам, поглощаемым хлорофиллом. Чтобы установить, как влияет на спектр поглощения различная концентрация пигмента, разводят вытяжку зеленого листка в соотношениях 1:1; 1:5; 1:15. Исследуют оптические свойства полученных пигментов. Рассматривают спектр поглощения бензиновой вытяжки из корнеплода моркови, содержащей каротин, и спиртовый раствор ксантофилла, полученного при распределении пигментов по Краусу.
Отчет о работе. Нарисуйте спектры поглощения спиртовой вытяжки из зеленого листка.
Контрольные вопросы
- Назовите основные физические свойства хлорофилла?
- Почему хлорофилл зеленого цвета?
- В каких частях спектра наблюдается максимум поглощения хлорофилла?
- Чем отличаются спектры поглощения хлорофиллов а и b?
- Почему растения зеленого цвета?
- В какой части спектра хлорофилл не поглощает лучи?
Флуоресценция хлорофилла Растворы хлорофиллов в полярных растворителях имеют яркую флуоресценцию. В этиловом эфире у хлорофила а наблюдается рубиново-красная флуоресценция с максимумом 668 нм, у хлорофила b — 648 нм, то есть максимумы флуоресценции несколько смещены по отношению к максимумам поглощения. Известно, что флуоресценция — это свойство многих тел под воздействием падающего света в свою очередь испускать свет; при этом длина волны света, который испускается, обычно больше, чем длина волны возбуждающего света. Агрегированный хлорофилл и хлорофилл в нативном состоянии (в живом листке) имеет слабую флуоресценцию. Это, очевидно, объясняется поглощением света флуоресценции самими пигментами. Механизмы флуоресценции достаточно изучены. Поглощение молекулой хлорофилла кванта красного света приводит к синглетному электронозбудженному состоянию – S1. При поглощении синего света с более высоким уровнем энергии электрон переходит на более высокую орбиту (S2). Возбужденная молекула хлорофилла возвращается в основное состояние различными путями. Отдав часть энергии в виде тепла (особенно с уровня S*1), молекула может испустить квант света с большей длиной волны (правило Стокса), что проявляется в виде флуоресценции.
Цель работы: ознакомиться с физическим свойством хлорофилла — флуоресценцией.
Материалы и оборудование:
- Спиртовая вытяжка пигментов листка.
- Пипетки.
- Пробирки.
- Источник света.
- Листья элодеи (Elodea canadensis Michx.).
- Предметные и накрывные стекла.
- Микроскоп с синим светофильтром.
Ход работы. Спиртовую вытяжку пигментов или раствор хлорофилла в бензине, полученный при распределении пигментов по Краусу, размещают перед темным бумажным фоном у источника освещения. Рассматривают в отраженном свете. Вытяжка хлорофилла будет темно-красного цвета. Для наблюдения флуоресценции в живом листке элодеи, его располагают на предметном столике микроскопа. Освещают синех светом. Зеленые пластиды начинают светиться красным светом.
Контрольные вопросы
- Интенсивность флуоресценции хлорофилла в растворе в 10 раз выше, чем в нативном состоянии. Чем это обусловлено?
- Что такое квантовый выход фотосинтеза?
- Накончите схему переходов между возбужденными состояниями после поглощения синего и красного света хлорофиллом.
- Как объяснить разный цвет ацетоновой вытяжки хлорофилла в свете, проходящем сквозь нее, и в отраженном свете?
- Какие механизмы возникновения флуоресценции хлорофилла?
